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POS 1 (10) |
TETRACYCLINES |
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Révision 1 de la page |
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Méthode: 1
Numéro: 10
Révision: 30 mars 1993
DOSAGE DES RESIDUS DE TETRACYCLINES DANS LES TISSUS ET LE LAIT D'ORIGINE ANIMALE
Diffusé par:__________________
W.H.H. Farrington
(Responsable technique)
MAFF
Food Safety Directorate
Food Science Laboratory
Norwich Research Park
Colney
Norwich NR4 7UQ
1. SECURITE
Cette méthode comporte l'emploi de plusieurs produits chimiques et de modes opératoires dangereux susceptibles d'accroître les risques pour l'opérateur. En cas de doute, toujours consulter le conseiller compétent en matière de sécurité.
1.1 Précautions générales
1.1.1 Porter à tout moment des vêtements de protection, notamment une blouse de laboratoire (boutonnée), des lunettes de protection et des gants (de latex ou d'une matière analogue).
1.1.2 Les prélèvements de tissus doivent être considérés comme présentant un risque biologique. Il vaut mieux éviter le contact direct avec la peau et prendre les précautions d'hygiène voulues. L'emploi de scalpels et autres couteaux à lame très coupante doit toujours être précautionneux. Les coupures doivent être signalées immédiatement et soignées par une infirmière compétente.
1.1.3 Les opérateurs doivent se familiariser avec tout risque imputable aux produits chimiques et aux réactifs.
CONFORMEMENT AU REGLEMENT APPLICABLE AUX SUBSTANCES DANGEREUSES POUR LA SANTE (COSHH), CETTE METHODE DOIT FAIRE L'OBJET D'UNE EVALUATION DE TOUT RISQUE POUR LA SANTE DES OPERATEURS QUE COMPORTE SON EMPLOI. L'EVALUATION COMPLETE SUPPOSE QUE L'ON REMPLISSE LES DOCUMENTS COSHH1 ET COSHH2, ET QU'ILS SOIENT A LA FOIS CONSERVES DANS LE DOSSIER ET ACCESSIBLES AU PERSONNEL. AVANT DE COMMENCER A UTILISER CETTE METHODE, TOUTE PERSONNE DOIT ETRE EN POSSESSION D'UN EXEMPLAIRE DU DOCUMENT COSHH2. IL FAUT CONSULTER LE CODE D'USAGE CONCERNANT LES MEDICAMENTS VETERINAIRES AVANT DE COMMENCER A APPLIQUER LA METHODE.
L'attention est appelée en particulier sur certains solvants organiques et produits chimiques qui peuvent être toxiques et/ou inflammables. Le contact par inhalation, par absorption cutanée ou par ingestion doit être évité, et il faut si nécessaire travailler dans une sorbonne.
Le méthanol et l'acétonitrile sont toxiques.
Les antibiotiques de type tétracycline figurent sur la liste des produits toxiques.
L'acide b-Mercaptopropionique est corrosif et toxique.
Aucune autre substance ne figurant pas sur cette liste n'est réputée sûre.
1.2 Premiers soins
Toute blessure doit être signalée en premier lieu à une infirmière qualifiée et consignée dans le carnet des accidents qui accompagne toutes les trousses de premier secours. L'infirmière décide de la suite à donner. Tout accident, incident et situation de quasi-incident doit être signalé en remplissant l'imprimé DHSU 1.
2. INTRODUCTION
Les tétracyclines sont un groupe d'antibiotiques utilisés de manière curative et préventive en zootechnie. Les plus courantes sont la tétracycline (TC), la chlortétracycline (CTC) et l'oxytétracycline (OTC).
La préoccupation que suscite l'éventuelle présence de résidus de ces médicaments dans les aliments a rendu nécessaire la mise au point de méthodes d'analyse pour suivre la présence de résidus de ces substances à l'état de traces.
Cette procédure opérationnelle standard (POS) peut être utilisée pour suivre les résidus des tétracyclines courantes (TC, CTC, OTC) dans les tissus animaux, à savoir les reins et les muscles de plusieurs espèces, notamment les porcins, bovins, ovins, poissons (muscles), volailles (muscles), crevettes, le corned beef, ainsi que le miel. Le lait de vache peut aussi être analyse' à l'aide de cette méthode. Celle-ci n'est destinée qu'à une surveillance quantitative permettant de détecter les échantillons pouvant contenir des tétracyclines.
3. PRINCIPE
L'échantillon est extrait par tampon et l'extrait est appliqué à une colonne contenant du cépharose chélatant, précédemment chargée d'ions de cuivre. Les tétracyclines sont éluées avec de l'acide versénique (EDTA). Le cuivre résiduel et les autres contaminants organiques sont ensuite enlevés par passage de l'extrait dans une colonne contenant une résine XAD-2 à partir de laquelle les tétracyclides sont éluées à l'aide de méthanol. Le dosage est effectué par chromatographie en phase liquide à haute performance avec détection en UV.
4. ECHANTILLONNAGE
Les procédures à suivre pour l'identification, l'enregistrement et l'entreposage de tous les échantillons figurent dans le Food Science Quality Manual CM2, Sections 9 et 10.
Pour l'analyse, des échantillons subdivisés sont prélevés de tranches fines de l'échantillon congelé, de manière que l'on ait un échantillon aussi représentatif que possible. Il est préférable d'éviter l'homogénéisation de l'ensemble de l'échantillon, car l'activité enzymatique accrue peut entraîner une perte de la substance à rechercher.
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5. |
APPAREILLAGE | ||
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5.1 |
Verrerie | ||
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5.1.1 |
Tubes pour centrifugeuse, 250 ml et 50 ml | ||
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5.1.2 |
Colonnes de verre de 200 mm x 20 mm de dimension intérieure munies d'un disque de verre fritte et d'un robinet d'arrêt | ||
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5.1.3 |
Entonnoir de filtration, 250 ml | ||
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5.1.4 |
Fioles coniques, 250 ml | ||
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5.1.5 |
Fioles piriformes, 50 ml | ||
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5.1.6 |
Fioles de 250 ml à fond rond | ||
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5.1.7 |
Pipettes à boule, 5 et 10 ml | ||
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5.1.8 |
Fioles de faible volume pour auto-échantillonneur | ||
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5.1.9 |
Porte-filtre entièrement en verre, 47 mm Millipore | ||
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5.1.10 |
Tubes à essai de 10 ml avec bouchon | ||
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5.2 |
Matériel | ||
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5.2.1 |
Homogénéisateur |
Ultra Turrax ou équivalent | |
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5.2.2 |
Mélangeur à tourbillon |
Whirlimixer (Fisons) ou équivalent | |
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5.2.3 |
Centrifugeuse |
MSE vitesse rapide 18 ou équivalent | |
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5.2.4 |
Bain à ultrasons |
L&R 140 S ou équivalent | |
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5.2.5 |
Evaporateur rotatif + bain-marié |
Buchi ou équivalent | |
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5.2.6 |
Papier filtre, 15 cm, type 541 |
Whatman | |
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5.2.7 |
Pipettes de sécurité 0,2 ml et 1 ml |
Gilson Pipetman | |
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5.2.8 |
Flacons pour centrifugeuse, 250 ml |
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5.2.9 |
Filtre à membrane 0,45 m m "Durapore", 47 mm |
Millipore U.K. Ltd | |
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5.2.10 |
Unité de séchage à thermostat et concentrateur d'échantillons |
Techne | |
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5.3 |
Chromatographie en phase liquide à haute performance | ||
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5.3.1 |
Pompe |
LKB 2150 ou équivalent | |
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5.3.2 |
Colonne |
20 cm x 3 mm d.i. Chromsep (Chrompack) colonne à cartouche garnie de Chromspher C8 avec colonne de garde intégrale (10 mm x 2,1 mm d.i.) garnie de phase inverse pelliculaire (30-40 m m). D'autres colonnes à phase inverse peuvent être acceptables. Phase mobile pompée à 0,4 ml/min (6.2.4). | |
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5.3.3 |
Détecteur |
Détection en UV à 350 nm (Severn Analytical, SA6510 ou équivalent). | |
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5.3.4 |
Traitement des données |
Intégrateur (Perkin Elmer/Nelson Turbochrom Software) | |
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5.3.5 |
Injection |
Autoéchantillonneur (Waters WISP 712 ou équivalent capable de faire des injections de 10 m l). | |
6. REACTIFS
Sauf indication contraire, les produits chimiques et solvants sont des réactifs de qualité appropriés pour analyse. On utilise toujours de l'eau déminéralisée distillée deux fois (ou équivalente).
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6.1 |
Produits chimiques |
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6.1.1 |
Base exempte de tétracycline |
Sigma Ltd |
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6.1.2 |
Chlortétracycline HCl |
Sigma Ltd |
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6.1.3 |
Oxytétracycline HCl |
Sigma Ltd |
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6.1.4 |
Acide succinique |
BDH |
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6.1.5 |
Solution de soude caustique 1,0 M |
BDH |
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6.1.6 |
Acide versénique sel disodique (EDTA) |
BDH |
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6.1.7 |
Méthanol |
BDH |
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6.1.8 |
Ethanol |
Burroughs Ltd |
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6.1.9 |
Acétonitrile |
Romil |
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6.1.10 |
Acide oxalique |
BDH |
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6.1.11 |
Chélatant Sépharose Fast Flow dans de l'éthanol à 20% |
Pharmacia |
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6.1.12 |
Amberlite XAD-2 |
BDH |
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6.1.13 |
Sulfate de cuivre |
BDH |
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6.1.14 |
Acide b-Mercaptopropionique (acide thiolactique) |
Aldrich |
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6.1.15 |
Acétone |
Rathburn |
6.2 Solutions
6.2.1 Solution mère de succinate: 24 g d'acide succinique (6.1.4) dissous dans 1 litre d'eau pour constituer la solution mère, porté à un pH de 4,0 à l'aide d'une solution de soude caustique à 1,0 M (6.1.5) et à laquelle on ajoute de l'eau jusqu'à obtention d'un litre.
6.2.1.1 Tampon de succinate, pH 4,0: Prendre 250 ml de solution mère de succinate (6.2.1), diluer jusqu'à obtention de 800 ml à l'aide d'eau distillée, ajouter de la solution de soude caustique à 1,0 M (6.1.5) jusqu'à obtention d'un pH 4,0 et ajouter de l'eau distillée jusqu'à obtention d'un litre.
6.2.2 EDTA - Tampon au succinate: Comme plus haut en ajoutant 37,2 g de sel dissodique d'EDTA (6.1.6) avant d'ajuster le pH et d'ajouter de l'eau jusqu'à obtention d'un litre.
6.2.3 Acide oxalique à 0,01M Dissoudre 1,26 g d'acide oxalique (6.1.10) et ajouter de l'eau jusqu'à obtention d'un litre.
6.2.4 Phase mobile pour chromatographie en phase liquide à haute performance: Ajouter à 500 ml d'acide oxalique à 0,01 M (6.2.3) 500 ml d'acétonitrile (6.1.9). Mélanger et passer à travers un filtre à mailles de 0,45 m m (5.2.9), puis faire le vide (5.1.9). Dégazer encore aux ultrasons (5.2.4) et en abaissant la pression.
6.2.5 Solution de sulfate de cuivre Dissoudre 5,0 g de sulfate de cuivre (6.1.13) dans un litre d'eau distillée.
6.2.6 Solution d'acide b-mercaptopropionique: Dissoudre 0,5 g d'acide b-mercaptopropionique (6.1.14) dans 10 ml de méthanol (6.1.7).
6.3 Préparations des colonnes
6.3.1 Chélatant Sepharose
Mélanger soigneusement la suspension de chélatant Sepharose (6.1.11). Prendre une portion de 5 ml et la verser dans une colonne de verre de 200 mm x 20 mm de diamètre intérieur (5.1.2), laisser reposer (hauteur du lit 1,5 cm) et enlever le liquide en excès. Laver de nouveau la colonne avec 15 ml d'eau. Verser 2 x 10 ml de solution de sulfate de cuivre (6.2.5) dans la colonne, puis 15 ml de tampon au succinate (6.2.1.1).
NB. Mélanger en tournant le contenu de la colonne après la première adjonction de 10 ml de solution de sulfate de cuivre pour assurer un revêtement égal. Après utilisation, les colonnes sont rincées à l'aide de 15 à 20 ml d'eau. Elles peuvent être conservées dans l'éthanol aqueux à 20% à température ambiante pendant une nuit ou réfrigérées pendant des périodes plus longues. Avant utilisation, on élimine l'éthanol aqueux de la colonne et on recharge celle-ci de solution de sulfate de cuivre, et on poursuit le cycle comme précédemment. Si des canaux se forment dans le lit de Sepharose, il faut mélanger en tournant le contenu de la colonne pour assurer une dispersion régulière avant d'y introduire les échantillons.
6.3.2 Amberlite XAD-2
Prendre une portion de bouillie aqueuse de résine (6.1.12) et la placer dans des colonnes de verre de 200 mm x 20 mm de diamètre intérieur (5.1.2), jusqu'à obtention d'un lit d'une hauteur de 10 cm. On prépare la résine en versant successivement 100 ml d'acétone (6.1.15), 100 ml de méthanol (6.1.7) et 200 ml d'eau. Les colonnes doivent être conservées dans l'acétone avant d'être utilisées. Assurer une nouvelle dispersion du garnissage de la colonne en mettant plusieurs fois celle-ci la tête en bas pour permettre une répartition régulière. Eliminer le liquide en excès avant utilisation. (Après utilisation, les colonnes peuvent être régénérées de la même manière).
7. SOLUTIONS-ETALONS
7.1. Solutions de tétracycline:
Les solutions de tétracycline (6.1.1/2/3) doivent être conservées au réfrigérateur. Les solutions mères doivent être préparées chaque semaine et les solutions de travail, le jour même de leur emploi. Les procédures à appliquer pour manipuler et préparer les solutions étalons figurent dans le manuel de qualité du Laboratoire de bromatologie CM 2, section 10.
7.2 Solution mère étalon (1 m g/m l):
Ajouter 20 mg de tétracycline étalon à 20 ml de méthanol (6.1.7).
7.3 Solution étalon intermédiaire (10 ng/m l):
Diluer 1 ml de la solution mère (7.2) dans l'eau jusqu'à obtention de 100 ml.
7.4 Solution de travail (1 ng/m l):
Prendre 1 ml de 10 ng/m l (7.3), diluer jusqu'à obtention de 10 ml.
7.4.1 Les solutions d'ajouts doivent être préparées dans l'eau.
7.4.2 Solution étalon pour chromatographie en phase liquide à haute performance (1 ng/m l) préparée dans la phase mobile de chromatographie en phase liquide à haute performance. Prendre 5 ml de la solution étalon intermédiaire (7.3), diluer jusqu'à obtention de 50 ml.
8. MODE OPERATOIRE (*Révisions plus loin pour les échantillons contentant des matières grasses)
8.1 Les extractions doivent être réalisées sur des lots de 8 échantillons au maximum par jour.
8.2.* Peser 10 g de tissu coupé en lamelles fines ou prendre 10 ml de lait et ajouter 100 ml de tampon au succinate (6.2.1.1) dans un flacon pour centrifugeuse (5.2.8). Placer dans un bain d'ultrasons (5.2.4) (environ 3 minutes). Homogénéiser (5.2.1) (environ 2 minutes) et centrifuger (5.2.3) (environ 5 minutes) à 1 400 f.c.r.
8.3.* Filtrer le surnageant à l'aide de papier filtre Whatman 541 (5.2.6) et l'introduire dans une colonne préparée contenant du chélatant Sepharose (6.3.1).
8.4 Attendre suffisamment pour que les filtrats aient absorbé le gel Sepharose, puis rincer la colonne successivement avec 10 ml d'eau, 30 ml de méthanol (6.1.7) et 2 x 10 ml d'eau (Le débit ne doit pas dépasser 2 ml/minute).
8.5 Faire passer 40 ml de tampon EDTA-succinate (6.2.2) dans la colonne, puis 10 ml supplémentaires de la même solution. Ajouter ensuite dans la colonne 2 ml d'eau, puis prélever et grouper les deux fractions.
8.6 Introduire les fractions d'EDTA succinate directement dans une colonne préparée à l'aide de résine XAD (6.3.2). Attendre que l'extrait soit absorbé par la résine.
8.7 Faire passer 2 x 100 ml d'eau dans la colonne et jeter l'éluat. Faire passer 100 ml de méthanol (6.1.7) (4 ml par minute) dans la colonne. Jeter les 10 premiers millilitres de l'éluant, recueillir le reste.
8.8.* Réduire le méthanol à un petit volume à l'aide d'un évaporateur rotatif et transférer intégralement l'extrait dans une fiole piriforme (5.1.5) avec 3 x 2 ml de méthanol (6.1.7).
8.9.* Ajouter environ 50 m l de solution d'acide B-mercaptopropionique à 5 pour cent (6.2.6) au résidu et éliminer le méthanol à l'aide d'un évaporateur rotatif (5.2.5) (température 40 ± 5°C). L'adjonction d'acénotrinile à ce moment-là favorisera l'évaporation.
8.10.* Faire à nouveau dissoudre le résidu dans 0,5 ml de la phase mobile pour chromatographie en phase liquide à haute performance (6.2.4). Prendre soin de récupérer intégralement le résidu de l'échantillon. On devrait utiliser un mélangeur à tourbillon (5.2.2) et un bain à ultrasons (5.2.4) pour être sûr que le résidu est dissous. Transvaser 1 extrait dans la fiole pour auto-échantillonneur (5.1.8).
8.11.* La chromatographie en phase gazeuse à haute performance est effectuée sur 10 m l d'extrait.
Procédure révisée pour les échantillons contentant des matières grasses (corned beef)
8.2.1 Peser 2 g de tissu finement émincé et ajouter 100 ml de tampon au succinate (6.2.1.1.) comme au 8.2.
8.3.1 Filtrer 50 ml du surnageant à l'aide de papier filtre Whatman 541 (5.2.6) et le placer dans une colonne préparée à l'aide de chélatant Sepharose (6.3.1).
8.8.1 Réduire le méthanol à un petit volume à l'aide d'un évaporateur rotatif, puis ajouter de l'acétonitrile (5-10 ml) pour favoriser l'évaporation complète. Verser intégralement l'extrait dans un tube à essai à bouchon de 10 ml avec 4 x 2 ml d'acétonitrile (5.1.10) (6.1.9).
8.9.1 Placer les tubes à essai dans une unité de séchage d'aluminium (5.2.10) (température 40 ± 5°C) et vaporiser l'acétonitrile sous un jet d'azote.
8.10.1 Faire à nouveau dissoudre le résidu dans 0,2 ml de phase mobile pour chromatographie en phase gazeuse à haute performance (6.2.4) puis continuer comme au point 8.10.
8.11.1 La chromatographie en phase gazeuse à haute performance est effectuée sur 20 m l d'extrait.
9. INTERPRETATION DES DONNEES CHROMATOGRAPHIQUES
9.1 Identification de la substance à analyser
L'identification des tétracyclines s'effectue par comparaison des temps de rétention du produit étalon, soit sous forme d'étalons de référence, soit dans des échantillons dopés, avec ceux de tous pics analogues dans l'échantillon. L'identification est acceptée si le temps de rétention et la forme du pic sont analogues à ceux de l'étalon ou de l'échantillon dopé.
En cas de doute, les échantillons positifs suspects peuvent être surdopés à l'aide d'une des tétracyclines étalons de manière que l'on mesure le degré de co-chromatographie.
On peut utiliser de la déméthylchlortétracycline (ou une autre tétracycline) comme étalon interne pour établir les temps de rétention relatifs et mesurer le détection des ajouts connus.
9.2 Calcul des résultats
9.2.1 Tri
On effectue au minimum trois injections (10 m l) de tétracycline étalon (lng/m l) pour déterminer le temps de rétention et la hauteur moyenne du pic (injection de 10 ng = 50 ng/g ppb) de la concentration de tissu). La concentration de l'échantillon (ng/g ou ppb) est calculée comme suit:
9.2.2 Positifs
Tous les positifs suspects doivent faire l'objet de nouvelles analyses sur des doubles. Une courbe complète des étalons (5 étalons injectés trois fois) correspondant à la gamme estimative de concentrations des échantillons suspects doit être construite. L'étalon le plus faible doit être 0 et l'étalon le plus élevé doit être supérieur de 10 pour cent à la concentration la plus élevée, calculée à partir du résultat du tri. Une correction doit être apportée pour tenir compte de la récupération (voir 9.2.2.1).
9.2.2.1 Correction pour tenir compte de la récupération
La récupération de la substance à analyser est déterminée pendant la deuxième analyse par incorporation, dans chaque lot, d'échantillons témoins dopés aux tétracyclines aune teneur analogue à celle de l'échantillon, calculée à partir du résultat du tri. La concentration dans l'échantillon doit être corrigée en multipliant par 100 et en divisant par X, X étant le chiffre moyen de la récupération en pourcentage pour le lot en question, obtenu à partir des échantillons dopés.
9.3 Expression des données
Toutes les donnés qualitatives et quantitatives doivent être consignées par écrit (voir Manuel de qualité CM2, section 10, du laboratoire de bromatologie). Pour les rapports définitifs, le NIVEAU D'INTERVENTION (concentration de la substance à analyser détectée dans un échantillon donné) nécessitant une nouvelle analyse d'un échantillon, varie selon le programme. En général, les programmes de surveillance ont des limites fondées sur la LMR (limite maximale de résidu), mais toutes les teneurs à signaler doivent être confirmées par le responsable de projet et le responsable technique avant le commencement de l'analyse. Sauf indication contraire, tous les résultats doivent être corrigés pour tenir compte de la récupération. Les fiches d'analyse doivent indiquer clairement l'absence ou la présence d'une correction des résultats.
10. PROCEDURES D'ASSURANCE-QUALITE
10.1 Validation de la méthode avant son emploi
Lorsque cette méthode doit être utilisée par un opérateur pour la première fois, elle doit être intégralement validée au point de vue de sa répétabilité et sa reproductibilite' internes. L'ensemble de la procédure doit être réalisé sur un seul lot d'échantillons, et ce, à trois dates différentes. Chaque lot sera compose d'un tissu témoin connu subdivisé en cinq échantillons témoins au minimum. Quatre échantillons sont dopés aune concentration appropriée (fixée par le responsable du projet), mais qui correspond habituellement à 0,05 mg/kg (soit 500 m L de la solution de travail 7.4 ayant une teneur de lng/1 m L). L'échantillon restant est utilisé comme témoin de référence.
Une validation complète doit être effectuée pour tous les types d'échantillons, autres que ceux indiqués dans l'introduction et pour lesquels on ne dispose pas d'un dossier antérieur de validation.
Lorsqu'on revient à une méthode après une interruption pendant un temps, elle doit être validée sur un lot au moins avant d'être appliquée. La récupération de la substance à analyser doit se situer dans la fourchette 50-110 pour cent. Les valeurs de VC doivent être inférieures à 15 pour cent pour la précision d'un lot à l'autre et à l'intérieur d'un même lot.
10.2 Contrôle de la qualité de la méthode de tri
Aux fins de référence pour le contrôle de la qualité, chaque lot doit toujours contenir:
10.2.1 Un échantillon dopé à la tétracycline, à la chlortétracycline et à l'oxytétracycline à raison de 0,05 mg/kg. Si la récupération de la substance à analyser à partir de l'échantillon dopé ne se situe pas dans les fourchettes acceptables (définies plus haut au point 10.1), le lot doit être rejeté.
10.2.2 Ou bien, on peut utiliser de la déméthylchlortétracycline (ou une autre tétracycline) comme étalon interne dans tous les échantillons pour mesurer la récupération pendant l'extraction. La récupération de déméthylclortetracycline dans des échantillons dopés ne doit pas être inférieure à 40 pour cent ni supérieure à 110 pour cent. Lorsque la récupération n'entre pas dans cette fourchette, le lot doit être rejeté. Lorsqu'un positif suspect est découvert, il est possible que les produits de l'analyse (en particulier ceux de la chlortétracycline) altèrent le pic de la déméthylchlortétracycline. Dans ce cas, il faut procéder à une nouvelle analyse en utilisant une autre tétracycline (en général de l'oxytétracycline) comme étalon interne.
10.3 Contrôle de la qualité de la méthode pour la nouvelle analyse
Deux échantillons témoins sont dopés à la tétracycline, à la chlortétracycline et à l'oxytétracycline à une concentration appropriée (voir 9.2.2.1). Si la récupération de la substance recherchée dans l'échantillon dopé se situe hors des fourchettes acceptables (définies plus haut au point 10.1), alors, le lot doit être rejeté.
10.4 Limite de détermination
La limite quantitative de détermination est la valeur la plus faible à laquelle la procédure a été validée avec des échantillons dopés. Elle peut varier selon les types d'échantillons, mais on a mis en évidence une teneur de 0,010 mg/kg de tétracycline, de chlortétracycline et d'oxytétracycline tant dans les abats que dans les muscles.
